谷氨酸棒杆菌用于生产稀有糖
天津工业生物技术研究所孙媛霞年11月发表于“JAGRFOODCHEM"杂志
"PathwayConstructioninCorynebacteriumglutamicumandStrainEngineeringToProduceRareSugarsfromGlycerol"
稀有糖是在自然界中存在，但含量极少的一类单糖（主要是L-Sugars）及衍生物。稀有糖可作为食品添加剂和医药中间体，在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。稀有糖的典型代表有：L-山梨糖（可用来合成糖苷酶抑制剂脱氧半乳糖野生霉素和抗坏血酸）、L-果糖（非营养甜味剂，糖苷酶抑制剂、杀虫剂）、L-阿洛酮糖（鼠单纯疱疹性角膜炎抑制剂）。
自然界中，许多植物和微生物可以积累少量稀有糖。已在大肠和谷棒中构建完成基于醛缩酶和磷酸酶的几种重组途径，可以利用葡萄糖和醛来生成稀有糖。尽管如此，由于醛类非常不稳定，导致其转化率较低。
甘油是生物柴油的主要副产物，可用其作为底物来生产高附加值产品。甘油不仅可以转化为C3醛类，包括L-甘油醛和3-羟基丙醛（分别由乙醇脱氢酶和甘油脱氢酶催化），还可以转化为DHAP（二羟丙酮磷酸）。因此，甘油在微生物合成稀有糖中具有重要潜在价值。
本研究通过利用DHAP依赖的醛缩酶，以甘油为底物合成稀有糖。稀有糖合成途径包括3个模块：DHAP合成模块（催化甘油生成DHAP）、受体醛类合成模块（催化甘油生成3-羟基丙醛和L-甘油醛）和羟醛缩合反应模块（DHAP与3-羟基丙醛或L-甘油醛进行羟醛缩合）。
1）DHAP合成模块构建：谷棒没有内源代谢甘油的途径，通过引入大肠杆菌的GlpF基因(glycerolfacilitator)、肺炎克雷伯氏菌的DhaD基因(glyceroldehydrogenase)和弗氏柠檬酸杆菌的DhaK基因(dihydroxyacetonekinase)，构建了利用甘油合成DHAP的途径。
2）受体醛合成模块构建：将不同来源的ADH（乙醇脱氢酶，alcoholdehydrogenases）与DhaB（甘油醛脱水酶，glyceroldehydratase）进行酶活比较，最终选择来自马肝脏的ADH和来自克雷伯氏菌的DhaB，用于催化甘油生成3-羟基丙醛和L-甘油醛。
3）羟醛缩合反应模块构建：DHAP依赖的醛缩酶对DHAP具有严格的底物特异性，催化DHAP和各种醛类的羟醛/醛醇反应，生成复杂的聚羟基糖类。分别利用质粒表达4种来自谷棒的醛缩酶（rhamnulose1-phosphatealdolase(RhaD)，fructose1,6-diphosphatealdolase(FruA)，tagatose1,6-diphosphatealdolase(TagA)，fructose-1-phosphatase(YqaB)）和2种来自大肠杆菌的醛缩酶（fuculose1-phosphatealdolase(FucA)，YqaB）。
鉴于DHAP的成本高及在糖酵解途径的不稳定性，敲除丙糖磷酸异构酶(TPI)，以增加DHAP在胞内的积累。
进一步对工程菌株进行发酵优化，ml摇瓶补料发酵72h，最终生成38.1g/L5-脱氧阿洛酮糖，20.8g/LL-果糖,10.3g/LL-塔格糖,1.2g/L37L-山梨糖和0.95g/LL-阿洛酮糖。
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