感染性角膜炎的分子诊断技术研究进展

作者：赵格谢立信

来源：中华眼科杂志,,51(09):-.

摘要

感染性角膜炎是一种严重的致盲性眼病。目前培养法仍被认为是诊断眼科感染的金标准，但是其具有阳性率低、耗时长等缺点。开发快速、敏感的感染性角膜炎早期诊断方法，对及时有效地指导临床进行药物治疗非常重要。分子诊断技术通过检测病原体特异核酸确定致病微生物，具有灵敏、特异、快速、高通量等优点。本文对近年感染性角膜炎诊断领域中各种分子诊断技术的研究应用现状进行综述，并讨论分子诊断技术在角膜炎的病原体检测中存在的问题及应用前景。

感染性角膜炎是由细菌、真菌、病毒和棘阿米巴原虫感染引发的角膜溃疡，若不及时治疗，很容易致盲，尤其在发展中国家，每10万人中就有例感染性角膜病患者，且50％以上的感染性角膜炎是由真菌引起。感染性角膜炎通常发展非常迅速，很容易造成角膜穿孔，最终需要手术治疗。尤其对于部分患者，单纯根据其临床症状很难准确判断病原体，导致无法及时正确用药而使病情加重。因此，感染性角膜炎的早期快速诊断对于合理选择抗微生物制剂进行及时有效的治疗非常重要，可以达到更好的防盲治盲效果。

目前临床感染性角膜炎的诊断金标准还是实验室培养法。对病变刮取物或组织进行病原微生物培养是明确诊断的最可靠依据。但是，这种培养法耗时长，细菌多需要3~5d时间，真菌、病毒和棘阿米巴原虫则需要5~7d时间，无法提供早期诊断结果，易延误治疗，而患者之前的用药还可降低培养的阳性率。其次，临床使用较多的方法是对病变组织进行涂片检查，即涂片法。这种方法虽快速简便，但主观性较强，且依赖于技术人员的经验。激光共聚焦显微镜观察作为一种先进的无创性诊断技术，对角膜病变组织直接进行观察，是近年新兴的诊断方法，但其确定诊断具有局限性，且需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，医院普及使用。由此可见，感染性角膜炎现行的实验室诊断方法或阳性率低、耗时长，或有较强的主观依赖性，医院临床对患者进行早期、快速诊断以指导治疗的需要。

分子生物学检测技术为感染性角膜炎的早期诊断提供了新的思路，其发展旨在增加病原体检测的敏感性和特异性，扩大检测的病原谱，缩短检测时间，减少抗菌药物对病原体检测的影响。近年来围绕利用分子诊断技术对感染性角膜炎致病微生物进行检测已经相继开展了大量研究，随着检测方法的不断优化，其优越性也日益凸显。本文对分子诊断技术在感染性角膜炎实验室诊断中的研究现状进行综述，同时探讨其临床应用存在的问题，并展望其发展方向。

1用于检测病原微生物的分子诊断技术

致病微生物一旦感染机体，便可在机体内留下分子印迹，而核酸就是其中的一种。随着基因组技术的提高和广泛使用，各种微生物核酸序列被不断发现，因此根据致病微生物留下的特异分子印迹，通过分子生物学检测技术即可识别。靶标序列的选择是分子诊断成功的关键。核糖体rRNA基因被认为是一种重要的遗传标记，已被广泛用于许多细菌、真菌和棘阿米巴原虫所致疾病的诊断以及分析系统发育与进化关系的研究中。细菌的16SrRNA、真菌的18SrRNA和内转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）以及棘阿米巴原虫的18SrRNA等，由于这些序列在基因组中串联重复，既有进化较慢的保守区，可以用来设计同类微生物的通用鉴定引物，又有进化较快的可变区，可用来设计种属特异性鉴定引物，因此均是分子鉴定中最常使用的核酸序列。

当前，应用于临床实验室致病微生物检测的分子诊断技术主要包括病原核酸扩增、核酸杂交、DNA指纹分析和基因芯片等。核酸扩增是应用最为广泛的检测方法，其中最常见的是聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction，PCR），由其衍生的巢式PCR、多重PCR、Real-timePCR等更灵敏特异的检测方法也屡见报道。此外，环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）由于高效且便捷、无需常规PCR仪、医院普及等优点，近年来也受到追捧。今年由英国TwistDx公司开发的重组酶聚合酶扩增（re







































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