先进技术角膜交联治疗感染性角膜溃疡

概述

角膜交联亦可应用于角膜溃疡中，特别是利用紫外光-核黄素联合抗感染药物治疗感染性角膜溃疡。实际上，利用核黄素的光敏作用消除病原菌在内科输液中早有应用，以期增加输液的安全性，减少感染的风险。其原理就是核黄素激发作用和光敏作用。光敏作用抗微生物的抗菌谱很宽，其机制包括紫外线对遗传物质的直接作用、非特异性氧化应激反应，以及核黄素介导的特异性反应，该反应会导致微生物DNA或RNA鸟嘌呤残端氧化。

角膜炎产生角膜溃疡融解在临床中极为常见。但药物控制不理想时处理相当棘手，可能产生严重并发症甚至致盲。另外，抗生素的多重耐药也是治疗无效的原因之一。因此，临床上要求医师不断寻找新的治疗微生物感染角膜炎的方法，而紫外光-核黄素角膜交联术可能成为治疗感染性角膜病的新方法。

体外研究现状

紫外光-核黄素的抗菌作用已经通过对琼脂培养基上的细菌照射等试验得到证实。目前感染性角膜病的常见细菌菌种均可以通过紫外光-核黄素得到抑制甚至消除。为了进一步研究紫外光核黄素交联抗细菌疗效的量效关系，许多学者进行了大量的研究。在培养菌株中加入不同浓度核黄素，并分别进行不同时长的紫外线照射。紫外线参数为CXL治疗的nm。数据表明，紫外光单独照射几乎没有杀菌作用；紫外光联合核黄素组细菌数量明显减少，这种减少效应与紫外线有明显的剂量相关性。故推测核黄素抗细菌作用与后续的氧化损伤有关。另外，只需要很低浓度的核黄素（0.01%）即可与紫外线联合发挥消除病原微生物的作用，增加核黄素浓度只能轻微增强其抗菌能力。有趣的是，维生素B2的活性作用可以增加两性霉素B的抗真菌作用。建立兔镰刀菌性角膜炎动物实验模型，再对其进行紫外光核黄素治疗后，菌丝数量和炎症细胞数量都明显减少。对于棘阿米巴原虫，通过对仓鼠阿米巴性角膜炎进行体外研究，未能发现光氧化对其有消除作用。

临床应用现状

自上述报道后，临床上出现了很多利用CXL治疗难治性角膜溃疡的报道，治疗包括严重的细菌性角膜溃疡，各类角膜融解，真菌性角膜溃疡、阿米巴性角膜炎等疾病。这类报道多数是个案报道，但是总体而言治疗成功的案例非常多。一些影响疗效的因素，例如感染病原种类、溃疡本身特点（浸润深度、持续时间、面积），在CXL治疗之前所采取的治疗措施以及角膜溃疡融解程度的不同等，导致各报道的成功率不同。例如，Iseli等报道了5例真菌和细菌感染通过CXL得到成功治疗。Khan等报道了3例药物治疗无效的阿米巴感染。大部分研究取得了积极的治疗效果。Ehlers等则报道了治疗的低成功率（6/14），其入组的病人为不同原因导致的难治性角膜溃疡。

可见，CXL在临床治疗感染性角膜病方面具有积极意义。然而，作为一种光化学治疗，CXL并不是抗生素的替代，而是在原有治疗基础上的一种辅助治疗。因此，如何开始这一辅助治疗，手术时机和患者适应症都很重要。大多数情况下，细菌性角膜炎如果给予早期足量抗生素积极治疗，绝大多数疗效较好。当遇到有角膜进行性融解或者溃疡加重趋势者，在应用抗生素进行常规治疗的同时，应考虑行CXL。当然，还需要循证医学证据进一步阐明。

另一方面，在消除病原的同时，核黄素紫外光照射产生的光氧化作用可以使白细胞失活，减轻和调节炎症反应。而机体产生的炎症反应很大程度上决定着感染性角膜病变的预后。所以一部分临床效应可以通过角膜炎症细胞的作用来解释。交联术后患者症状的减轻，炎症反应的好转和基质溶解的减轻，在一定程度上与机体免疫细胞如角膜抗原提呈细胞、树突状细胞和Langerhans细胞等的免疫调节作用相关。有学者认为，CXL术后的无菌性角膜溃疡发生就可以通过组织中免疫细胞的作用来解释。

角膜交联是治疗感染性角膜病的重要手段

目前很多观点均支持CXL成为感染性角膜病的标准治疗方法之一。CXL治疗感染性角膜病的原理包括：消除微生物，增加角膜的抗酶活性，以及减轻相关的炎症反应等等。因为大多数抗生素都只能作用于这些的其中之一，所以CXL将来可能成为感染性角膜病变的一种有效治疗方法。如果证实其安全、有效，紫外光的照射过程将有多种潜在的好处，将这些作用综合起来，将对重症感染性角膜病变起到明显的作用。因为氧化性应激对生物学效应的调节与抗生素不同，CXL可以治疗治疗抗生素治疗无效的角膜溃疡和无菌性角膜溃疡。虽然治疗圆锥角膜的紫外线剂量远远不能将病原完全消灭，但是CXL对于阻止角膜基质进一步融解，调节角膜免疫反应等都有积极作用。另外，病人将需要住院治疗以进行CXL手术，住院患者使用局部抗生素药物更为规律和可控。

CXL治疗感染性角膜病变方面并没有随机对照临床试验。与治疗作用相反，CXL治疗圆锥角膜术后可能产生一系列并发症，包括角膜融解、感染性角膜病变、疱疹病毒性角膜炎等。这说明虽然CXL是一个十分安全的手术，但是氧化应激的临床反应在存在很大的个体差异。因此需要一个较大样本量的随机对照临床试验研，比较单纯使用抗生素与使用抗生素同时联合CXL的疗效差异，证实CXL是感染性角膜疾病的一种有效的补充治疗方法；同时对何时进行交联手术干预给出循证医学证据。

对于角膜基质较薄的患者进行紫外光照射，同样可能造成对内皮细胞的损伤。对大多数角膜溃疡患者，角膜水肿增厚，紫外光不易穿透至深层基质，CXL较为安全。但对厚度较薄的角膜，建议使用低渗性核黄素辅助增加角膜厚度。CXL的另外一个局限在于紫外光的穿透能力有限。角膜发生光化学反应的主要范围在角膜前基质层，主要位于前部μm。所以对于深层的角膜溃疡，用紫外光照射难以达到足够的治疗效应。但对于深层角膜溃疡，CXL仍然具有一定的消除病原以及增加基质耐酶性等作用。

笔者对近年就诊我院的不同类型感染性角膜溃疡进行了角膜交联治疗，发现角膜交联具有显著的治疗效果。我们认为，在我国，角膜交联对感染性角膜溃疡的意义远大于发达国家，在医院的重要治疗手段之一，值得大力推广。

此处以真菌性角膜溃疡为例，介绍常规CXL的手术步骤（图1，①至⑥）。

基本手术步骤：

①术前充分表面麻醉，消毒铺巾②刮除表面病灶及周边2mm上皮

③滴核黄素（Ricrolin等渗/低渗）1分钟1次④继续滴用核黄素，共15分钟

⑤紫外光9mW/cm2照射10分钟（UVX-）⑥照射期间2分钟滴1次核黄素补充消耗

▲图1CXL治疗感染性角膜溃疡的基本步骤

第一部分、角膜交联治疗真菌性角膜溃疡

真菌性角膜溃疡是致病性真菌感染引起的一种严重的致盲性角膜疾病，尤其在作为农业大国的中国，其发病率高，且目前临床缺乏其特异性抗真菌药物，治疗棘手。角膜胶原交联疗法作为近年来开展的一种增强角膜强度的光化学疗法，已有学者将其用于角膜溃疡的治疗，并取得良好疗效。本部分旨在探讨CXL治疗难治性真菌性角膜溃疡的可行性以及临床疗效。数据囊括年11月至年12月于厦门大学附属厦门眼科中心住院治疗的82例真菌性角膜溃疡患者，并将其结果汇总如下。

患者与方法

一、临床资料

1．研究对象：医院伦理委员会同意后，非随机回顾性收集年11月至年12月于厦门大学附属厦门眼科中心住院治疗的真菌性角膜溃疡患者82例，男性48例，女性34例，年龄18-81岁，平均52±13岁。所有患者均充分交代病情，签署知情同意书。

2.真菌性角膜溃疡诊断标准：①10%氢氧化钾涂片找到菌丝；②共聚焦显微镜检测到菌丝或孢子；③角膜刮片培养有真菌生长。以上三个条件符合其中之一即可诊断。

3.术前角膜溃疡情况：

①溃疡面积：≤4*4mm2者23例，4*4mm2-7*7mm2者49例，≥7*7mm2者10例；②病灶深度:结合裂隙灯显微镜以及共聚焦显微镜判断精确判断角膜浸润深度，但是对于溃疡病灶较深且致密的患者，无法通过共聚焦显微镜正确测量角膜溃疡深度，所以本研究采用裂隙灯显微镜判断角膜病灶浸润深度，≤1/3角膜厚度者15例，1/3-2/3角膜厚度者60例，≥2/3角膜厚度者7例；③伴前房积脓者15例。

4.评价指标：

4.1视力检查：采用对数视力表记录患者的最佳矫正视力检查。

4.2裂隙灯显微镜检查：结膜充血程度、上皮修复情况（联合角膜荧光素钠染色）、角膜溃疡病灶变化情况以及前房积脓等。

4.3激光共聚焦角膜显微镜（Invivolaserconfocalmicroscopy，德国海德堡公司）检查主要观察：①病灶区角膜上皮恢复情况；②炎性细胞密度和形态的变化;③局部真菌菌丝的有无及密度的高低，及菌丝侵犯基质的深度;④病灶区角膜基质细胞的变化。

二、治疗方法：

1.术前处理：术前应用0.5%氟康唑滴眼液（沈阳兴齐制药公司）Q1h，那他霉素滴眼液（美国爱尔康公司）Q1h，0.5%左氧氟沙星滴眼液（日本参天制药公司）Qid，普拉洛芬滴眼液（日本千寿制药株式会社）Qid，氧氟沙星眼膏（沈阳兴齐制药有限公司）Qn，根据肝肾功能情况决定是否应用伊曲康唑胶囊（西安杨森制药有限公司）0.2g，Qd以及氟康唑注射液mlQd（一般静脉用药时间不超过1周）。

2.手术指征:①上述联合针对性药物治疗≥5天，角膜炎性反应未能控制，病灶继续扩大者；②上述联合药物治疗效果不佳，病灶无扩大或缩小，病程持续≥1个月者。

3.手术方法：0.5%盐酸丙美卡因滴眼液（美国爱尔康公司）点眼3次，大量生理盐水冲洗术眼，尤其注意冲洗结膜囊及溃疡表面；以角膜上皮刀刮除溃疡表面苔被及周围浸润组织（角膜溶解变薄者除外）；0.1%的核黄素右旋糖酐(IROCInnocross，瑞士)局部点眼，每2min1次，持续30min；UV-X灯进行照射，照射参数：波长为nm，辐射度为9mW/cm2，总能量相当于5.4J/cm2，照射时间10min，光束的直径控制为7mm或9mm（根据溃疡面积大小决定）。在照射过程中，每2min滴用0.1%的核黄素右旋糖酐。照射结束后，氧氟沙星眼膏包扎术眼。

三、术后处理

继续术前用药，术后观察角膜溃疡情况，眼部情况稳定者予以出院，门诊定期复查，并根据溃疡恢复情况以及共聚焦显微镜检查结果酌情减药或停药。感染不能控制，病情进一步加重，根据患者情况选择角膜移植手术或者自体结膜瓣遮盖术。

四、随访

术后随访3月至3年，随访时间分别为：1周±1天，2周±1天，1月±1周；3月±1周；6月±1周；1年±1月；2年±2月；3年±2月；部分患者眼部情况稳定后未能严格随访，但均以电话随访方式确定患者目前情况稳定，无复发迹象。

结果

1.角膜溃疡愈合情况：

入组所有患者术后观察时间3月至3年，角膜溃疡逐渐愈合形成不同程度瘢痕71例（愈合率86.59%），图2、图3分别显示2例患者不同时间角膜溃疡恢复情况。病情仍然进一步加重急性期行角膜移植手术患者8例，急性期行自体结膜瓣遮盖术1例；溃疡稳定但再次复发加重并行角膜移植术患者2例。根据角膜溃疡浸润深度、浸润面积以及前房积脓情况，分别计算角膜溃疡愈合率，详见表1、表2。

表1不同浸润深度、浸润面积患者角膜溃疡愈合情况

溃疡描述

病例数

浸润深度

浸润面积

≤1/3AC

1/3AC-2/3AC

≥2/3AC

≤4*4

4*4-7*7

≥7*7

术前病例数

15

60

7

23

49

10

术后愈合例数

14

54

3

20

43

8

愈合率（%）

93.33

90.00

42.86

86.96

87.76

80

表2前房积脓与角膜溃疡愈合情况

病例数

伴前房积脓

无前房积脓

术前病例数

15

67

术后愈合例数

11

60

愈合率（%）

73.33

89.55

▲图2：病例1不同时间点裂隙灯照相：A：术前；B：术后1周；C：术后1月；D：术后3月；E：术后6月；F:术后1年；G：术后2年；C：术后3年

▲图3：病例2术前、术后不同时间点裂隙灯照相

2.最佳矫正视力

入组82例患者，通过该手术以及术后联合用药，71例角膜溃疡愈合的患者术前术后最佳矫正视力分布情况见表3，视力＞0.1无需再次行角膜移植手术者共51例，其中36例患者视力＞0.3。结合术前以及溃疡修复后最佳矫正视力比较，术后视力提高者52例，无明显变化者15例，仅4例患者视力出现下降（表3）。

急性期行角膜移植手术的10例患者，7例患者视力得到提高，其中5例患者最佳矫正视力≥0.1。1例行自体结膜瓣遮盖术的患者，视力仅眼前手动，目前暂未行二期角膜移植手术。

表例患者术前以及术后角膜溃疡修复后最佳矫正视力分布情况

最佳矫正视力

术前病例数（例）

术后溃疡愈合后病例数（例）

≤0.02

25

9

0.02~0.05

8

3

0.05~0.1

6

8

0.1~0.3

18

15

＞0.3

14

36

3.CXL术前术后共聚焦显微镜检查结果:

共焦显微镜检查术前：①角膜上皮不同程度缺损；②病灶中央均表现为强烈反光,组织结构不清,为大量坏死物质、炎性细胞以及菌丝堆积而成，但具体较难分清；③周边浸润区可见呈弥漫、交错分布、大小不一的炎性细胞，82例患者中78例患者均可见不同分布程度的菌丝；④病灶区基本不能见到正常的角膜基质细胞，病灶边界模糊。CXL术后大部分患者均呈现为角膜溃疡逐渐修复的改变：①角膜上皮不同程度修复；②病灶中央强反光区减弱，逐渐纤维瘢痕化；③炎症细胞密度逐渐减少；④真菌性角膜溃疡患者菌丝逐渐减少甚至消失；⑤病灶及其周围区逐渐可见到正常的角膜基质细胞核，病灶边界逐渐清晰（图4）。

▲图4图A1、A2为术前共焦可见大量菌丝；B1、B2为术后1周，溃疡逐渐修复，菌丝逐渐减少；C1、C2为术后1月，角膜溃疡基本愈合，共聚焦显微镜未见菌丝，仅见纤维瘢痕增生。

真菌性角膜溃疡溃疡（fungalkeratitis）是致病性真菌感染引起的一种严重的致盲性角膜疾病，该病主要与植物性外伤、佩戴角膜接触镜、广谱抗生素滥用、长期应用糖皮质激素或免疫抑制剂以及患眼慢性眼表损伤性疾病有关。真菌性角膜炎正以逐年增高的发病率成为发展中国家主要的致盲性眼病之一，尤其在作为农业大国的中国，有报道称真菌性角膜炎居感染性角膜疾病致盲率的首位。另外，真菌性角膜炎致盲率的增加也与缺乏特效的抗真菌药物有关，到目前为止，仍未发现一种高效、低毒、广谱抗真菌的药物。在药物治疗无效或者效果不佳的情况下，角膜溃疡清创术、碘酊烧灼术、自体结膜瓣遮盖术、角膜溃疡基质内注药术、结膜下注药术、前房注药术等多种方法用于治疗真菌性角膜溃疡，但均各有利弊，其根治性方法角膜移植手术，因我国角膜材料的极其匮乏以及炎症急性期手术风险大、术后排斥反应等并发症发生几率高等原因而受到限制。

角膜胶原交联疗法是近年来开展的一种增强角膜强度的光化学疗法，在治疗进展期圆锥角膜方面应用最为广泛，随后在术后角膜扩张病、角膜变性、感染性角膜病变、大泡性角膜病变、供体材料组织、巩膜交联治疗高度近视等眼科领域广泛应用。角膜胶原交联治疗感染性角膜疾病首先是由SchnitzlerE应用于临床并报道了其良好的临床疗效，MartinsSA、GalperinG等通过动物实验证实，CXL对感染性角膜病变的有效性。临床应用方面，SeilerT、MicelliT、MorenH及笔者等都报道了CXL治疗感染性角膜病变的临床疗效并指出角膜交联技术可以用于急性期感染性角膜疾病的治疗，从而减少了急性期行角膜移植术。

目前关于CXL治疗真菌性角膜溃疡的报道，TabibianD等报道了1例出芽短梗霉菌感染性角膜溃疡通过CXL治疗成功，并提出将该方法作为一线治疗方法。LiZ通过对8例真菌性角膜溃疡患者行CXL，采用能量3mW/cm2，照射时间30分钟，术后恢复良好。在我们的研究中，共对82眼药物治疗无效或者效果不佳的真菌性角膜溃疡患者进行CXL治疗，术后联合抗真菌药物治疗，其中角膜溃疡愈合71例，成功率为86.59%，而且这71例患者中，术后视力提高者52例，视力＞0.3者36例。

关于CXL对不同浸润深度角膜溃疡治疗效果评估，我们将其分为≤1/3AC；1/3AC-2/3AC；≥2/3AC3组分别计算愈合率，并通过SPSS20.0统计软件，采用多个样本卡方检验计算：χ2＝12.，df＝2，P＝0.（＜0.05），具有统计学意义。分别将≤1/3AC与1/3AC-2/3AC以及1/3AC-2/3AC与≥2/3AC3组进行比较，前两者：χ2＝0.，df＝1，P＝0.（＞0.05），无统计学意义；后两者χ2＝10.，df＝1，P＝0.（＜0.05），具有统计学意义。从以上统计学分析，我们可以看出，不同的浸润深度影响着我们对手术方式的选择，CXL对浸润深度＜2/3AC的角膜溃疡患者的疗效明显优于≥2/3AC，这也与UddarajuM的报道不谋而合，UddarajuM通过将13例深层浸润的真菌性角膜溃疡随机分为CXL组和对照组，发现CXL对深层角膜溃疡的愈合不但没有促进左右，反而增加了角膜穿孔的风险。这也与CXL的作用机制相一致，目前CXL治疗感染性角膜疾病的参数主要参照治疗圆锥角膜的参数，在该参数模式下，其主要作用于前方-um的角膜基质层组织，所以对深层角膜溃疡的治疗作用有限。

而分别将不同浸润面积分为≤4*4mm2；4*4mm2-7*7mm2；≥7*7mm2共3组，计算得出：χ2＝0.，df＝2，P＝0.（＞0.05），无统计学意义。是否伴前房积脓对角膜溃疡愈合率的影响，通过采用四格表资料的卡方检验：χ2＝2.，df＝1，P＝0.（＞0.05），无统计学意义。即浸润面积以及是否伴有前房积脓对术后角膜溃疡愈合率无影响。

本研究通过对82例真菌性角膜溃疡患者行CXL，术后联合抗真菌药物治疗，可以促进角膜溃疡愈合，取得了良好疗效，减少了急性期行角膜移植以及自体结膜瓣遮盖等手术，大部分患者视力得到提高，36例患者视力甚至＞0.3，而CXL手术简单易行，不失为治疗真菌性角膜溃疡的一种新的有效方法，但是对于深层浸润的真菌性角膜溃疡，不推荐使用CXL。

利于CXL治疗感染性角膜溃疡尚有许多问题待深入研究。例如，对于溃疡面积较小，CXL治疗时光斑照射病灶周边正常角膜，是否会对正常角膜基质细胞以及内皮细胞造成影响？另外CXL手术干预的最佳时机，一定要在药物治疗无效或者患者病情进一步加重的情况下，还是可以早期即行CXL，需进一步研究证实。我们的经验表明，在真菌性角膜溃疡诊断明确且病灶为浅中的情况的，可以在第一时间进行CXL术，术中刮除表面病灶，术后配合规范抗真菌治疗，能够较快较好地控制感染。当然，这一观点尚需要更大样本数据支持。

第二部分、细菌性角膜溃疡

与真菌性角膜溃疡相比，细菌性角膜溃疡的治疗相对“容易”，原因在于抗生素的大量使用和药物抗菌效应的不断增强。细菌性角膜溃疡发展为难治性角膜溃疡者并不很多。因此，笔者尚未能系统分析CXL治疗难治性细菌性角膜溃疡的真正疗效。BamdadS等纳入32例中度细菌性角膜溃疡患者，随机分为2组，即药物联合CXL治疗组与单纯药物治疗对照组，结果表明CXL治疗组的治疗周期为（17.2±4.1）天，而对照组为（24.7±5.5）天，另外CXL组上皮愈合明显快于对照组，病灶范围也较对照组明显减小，故作者认为药物联合CXL有利于加速细菌性角膜溃疡的愈合，缩短病程，减少手术需求。Richoz等则研究了提高交联能量对治疗培养的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的效应，发现使用36mW/cm2照射2.5分钟和使用18mW/cm2照射5分钟的杀灭效应基本一致。年Papaioannou等发表了CXL治疗感染性角膜溃疡的系统回顾和Meta分析，结果表明现有的研究成果支持CXL对感染性角膜溃疡具有积极意义这一结论，CXL对细菌性角膜溃疡的治疗有效率达到85.7%（95%可信区间为78.5%至91.7%）。但仍然需要更大样李的随机对照试验来支持。

从临床经验看，CXL对轻中度细菌性角膜溃疡确实具有积极作用。例如患者林某，确诊为细菌性角膜溃疡后使用足量规则抗生素5天无效，遂予CXL治疗（等渗+低渗法），后继续应用原有治疗药物，1月后复查，病情明显好转并形成浅层瘢痕（图5）。

▲图5常规药物不敏感的细菌性角膜溃疡接受CXL治疗后明显好转。

但对于部分细菌性溃疡患者，CXL无法发挥预期作用。如图6所示，患者潘某接受了CXL联合药物治疗，但最终病情加重，接受了治疗性角膜移植。因此，虽然目前研究显示CXL作为感染性角膜疾病以及角膜融解症的一种有效的补充治疗，可以减少角膜溃疡并发症的发生，减少治疗性角膜移植术，提高溃疡愈合率。但主要适应证还是对于药物治疗无效、溃疡进一步进展的细菌性角膜溃疡患者。但目前标准的用于治疗细菌性角膜溃疡的CXL还不十分成熟，主要的问题还在于适应证选择和手术时机等方面。笔者推测，对于匍行性角膜溃疡等病变位于角膜浅中层者，理论上CXL治疗效果多数较好，病灶周边角膜能够被动增加组织致密性和增加耐酶性，有利于病变局限化。而对于较快发生深层浸润或坏死的细菌性溃疡，CXL针对病灶周边基质纤维的增强一般不足够抵抗浸润或坏死的发展，而且CXL对病灶内部还有一定程度的加剧损伤的可能，因此CXL可能起到反作用。因此如何有效应用CXL治疗细菌性角膜溃疡还需要大量深入研究。

▲图6患者潘某，接受CXL治疗疗效不佳，最终接受了角膜移植术。

作者：林志荣吴护平

注：本文摘自《角膜交联技术及临床应用》，吴护平、林志荣主编，。

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